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ChIP

貨號:GM1008

品牌:Servicebio

價格:¥5000

規格:

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  一、項目介紹

  ChIP 是目前唯一研究體內 DNA 與蛋白質相互作用的方 法,它不僅可以檢測體內反式作用因子與 DNA 的相互作用, 還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達關系。

  二、ChIP實驗步驟

  第一天:

  (一)、細胞的甲醛交聯與超聲破碎

  1、取出1平皿細胞(10cm平皿),加入190ul 37%甲醛,使得甲醛的終濃度為1%。(培養基共有7ml,加完之后輕輕搖晃一下,使甲醛分布均一些)

  2、37℃孵育10min。(恒溫培養箱,培養箱要提前開啟)

  3、終止交聯:加 350ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混勻后,在室溫下放置5min即可。

  4、吸盡培養基,用冰冷的PBS清洗細胞3次。

  5、用PBS將細胞刮下來,2000g離心5min,去上清。

  6、加入含蛋白酶抑制劑的SDS裂解液(或IP裂解液)裂解細胞(裂解液的量視細胞沉淀量而加,一般50ul左右的沉淀加400-600ul的裂解液)。

  7、冰上充分裂解30min,裂解過程中用槍反復吹打細胞(或者放在漩渦混勻器上震蕩),使其充分裂解。

  8、超聲破碎:寧波新芝 JY 92-IIN,2#探頭,20%功率,4.5S超聲,10.5S間隙。4min, 總計超聲次數16次。超聲過程中請一定注意要保持樣品處于冰浴中,避免超聲出現泡沫,并且處于較低溫度(超聲的時間和功率可以根據超聲的效果進行調整,不同的細胞及細胞量超聲所需的時間略有差異)。

  (二)、除雜及抗體孵育

  1、超聲破碎結束后,12000rpm, 4℃,離心10min。去除不溶物質,取上清。留取2份50ul做input,其余保存于-80℃。(input實驗分為WB檢測和pcr加測+超聲效果檢測)

  2、取1份50ul超聲破碎后產物,加入1ul的蛋白酶K和2ul 5M NaCl(NaCl終濃度為0.2M),55℃過夜解交聯。

  3、解交聯結束后,測核酸濃度,取部分樣品進行PCR擴增,然后跑電泳,檢測超聲破碎的效果和確認樣品中含有目標DNA,同時將另外一份input蛋白變性跑WB,確認樣品中含有目標蛋白

  4、取100ul的超聲破碎產物,加入900ul 含1mM-PMSF的ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC(cooktail)。再各加入60ul Protein A +G Agarose/Salmon Sperm DNA。4度顛轉混勻1h(珠子和鮭魚精DNA加之前要充分混合均勻)。

  1h后,在4度靜置10min沉淀,4000rpm離心5min,取上清。

  5、一管中加入目的蛋白ChIP級別抗體1μg,另一管中加入對應種屬的IgG 1μg。4度顛轉過夜。

  第二天:

  (一)、免疫復合物的沉淀及清洗

  1、孵育過夜后,每管中加入80ul Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA,4度顛轉2h。

  2、4度靜置10min后,4000rpm離心1min。除去上清。

  3、依次用下列溶液清洗沉淀復合物。清洗的步驟:加入溶液,輕輕顛倒, 4000rpm 3次,4000rpm離心3min,除去上清。

  洗滌溶液:a. low salt wash buffer----one wash

  b. high salt wash buffer-----one wash

  c. LiCl wash buffer------one wash

  d. TE buffer------two wash

  注:完成上述所有洗滌步驟后所獲得的沉淀即可用于Western檢測,在完成所有的洗滌步驟后,取30ul樣品加入30ul SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(1X),沸水浴煮沸10分鐘后上樣進行WB。

  4、現配Elution buffer(0.5gSDS+0.42gNaHCO3+50ml水),加500ul至沉淀;

  5、加5M NaCl 20μL,Protease K 1μL,65度過夜解交聯

  第三天:

  (一)、DNA樣品的回收

  1、回收DNA。(酚LF提取法)。

  2、即加等體積酚LF,震蕩,12000rpm x5min,,吸上層液體,

  3、+1/10體積3M CH3CooNa+預冷無水乙醇1mL,混勻,

  4、4度12000 RPM,15 min,棄上清,+-20℃預冷70%乙醇1ML,顛倒混勻,室溫12000 RPM ,離心5 min ,棄上清,待沉淀干燥透明,+20 μL 純水溶解。

  (二)、PCR分析

  設計引物進行PCR或者熒光定量PCR分析。

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