美人捕鱼作弊器

賽維爾生物服務、產品資料庫

賽維爾生物

TEL:400-6027-178

賽維爾生物

蛋白互作

  1. 首頁
  2. 全部分類
  3. 服務
  4. 蛋白
  5. 蛋白互作
  6. 內容

EMSA檢測

貨號:GM1010

品牌:Servicebio

價格:¥3000

規格:

附件下載地址: ×

一、項目介紹

EMSA 是一種用于研究核酸和蛋白質之間相互作用的技 術,適用于轉錄因子與啟動子相互作用的驗證性實驗,主要是 驗證蛋白質與特定核酸序列的結合特性,從而間接推斷已知蛋 白質的靶序列或已知序列的結合蛋白質分子。

 

二、實驗步驟

1、 蛋白的提取

漿蛋白核蛋白提取(細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒)

1.1 準備溶液:室溫融解試劑盒中的三種試劑,溶解后立即放置在冰上,混勻。取適當量的細胞漿蛋白抽提試劑A備用,在使用前數分鐘內加入PMSF,使PMSF的最終濃度為1mM。取適當量的細胞核蛋白抽提試劑備用,在使用前數分鐘內加入PMSF,使PMSF的最終濃度為1mM。

1.2 對于貼壁細胞:用PBS洗一遍,用細胞刮子刮下細胞,或用EDTA溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊,并用移液器吹打下細胞。離心收集細胞,盡最大努力吸盡上清,留下細胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

1.3 對于懸浮細胞:用PBS洗一遍,離心收集細胞,盡最大努力吸盡上清,留下細胞沉淀備用。

1.4 對于新鮮組織:

1.1 

1.2 

1.3 

1.4 

1.4.1 把組織盡可能切成非常細小的碎片。按照20:1的比例混合適當量的細胞漿蛋白抽提試劑A和B(例如200微升細胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B)。并加入PMSF至最終濃度為1mM配制成組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液,并在玻璃勻漿器內充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進行。

1.4.2 勻漿后把勻漿液轉移到塑料離心管內,冰浴放置15分鐘。

1.4.3  4℃ 1,500g離心5分鐘。把上清轉移至一預冷的塑料管中,為抽提得到的部分細胞漿蛋白。(吸上清時千萬不要觸及沉淀。)

1.4.4 對于沉淀,到了這一步已經充分勻漿,但很多細胞還沒有破碎。

1.4.5 

1.4.6 

1.4.7 

1.4.8 

1.4.9 

1.4.10 

1.4.11 

1.4.12 

1.4.13 

1.4.14 

1.4.15 

1.4.16 

1.4.17 

1.4.18 

1.4.19 

1.4.20 

1.4.21 

1.4.22 

1.4.23 

1.4.24 

1.4.25 

1.4.26 

1.4.27 

1.4.28 

1.4.29 

1.4.30 

1.4.31 

1.4.32 

1.4.33 

1.4.34 

1.4.35 

1.4.36 

1.4.37 

1.4.38 

1.4.39 

1.4.40 

1.4.41 

1.4.42 

1.4.5 每20微升細胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細胞漿蛋白抽提試劑A。(對于二百萬Hela細胞,其細胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)

1.1 

1.2 

1.3 

1.3.1 

1.3.2 

1.3.3 

1.3.4 

1.3 

1.3.4 

1.4 

1.4.1 

1.4.2 

1.4.3 

1.4.4 

1.4.6 最高速劇烈Vortex 5秒,把細胞沉淀完全懸浮并分散開。(如果細胞沉淀沒有完全懸浮并分散開,可以適當延長vortex時間。)

1.4.7 冰浴10-15分鐘。

1.4.8 加入細胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。最高速劇烈Vortex 5秒,冰浴1分鐘。

1.4.9 最高速劇烈Vortex 5秒,4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。

1.4.10 立即吸取上清至一預冷的塑料管中,即為抽提得到的細胞漿蛋白。可以立即使用,也可以凍存。(千萬不要觸及沉淀,可以在沉淀上方保留極小體積的上清,以免觸及沉淀。)

1.4.11  對于沉淀,完全吸盡殘余的上清,加入50微升添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會帶來細胞漿蛋白的污染。)

1.4.12  最高速劇烈Vortex 15-30秒,把細胞沉淀完全懸浮并分散開。然后放回冰浴中,每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒,共30分鐘。

1.4.13  4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。

1.5  每20微升細胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細胞漿蛋白抽提試劑A。(對于二百萬Hela細胞,其細胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)

1.6  最高速劇烈Vortex 5秒,把細胞沉淀完全懸浮并分散開。(如果細胞沉淀沒有完全懸浮并分散開,可以適當延長vortex時間。)

1.7  冰浴10-15分鐘。

1.8  加入細胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。最高速劇烈Vortex 5秒,冰浴1分鐘。

1.9  最高速劇烈Vortex 5秒,4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。

1.10  立即吸取上清至一預冷的塑料管中,即為抽提得到的細胞漿蛋白。可以立即使用,也可以凍存。(千萬不要觸及沉淀,可以在沉淀上方保留極小體積的上清,以免觸及沉淀。)

1.11  對于沉淀,完全吸盡殘余的上清,加入50微升添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會帶來細胞漿蛋白的污染。)

1.12  最高速劇烈Vortex 15-30秒,把細胞沉淀完全懸浮并分散開。然后放回冰浴中,每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒,共30分鐘。

1.13  4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。

1.14  立即吸取上清至一預冷的塑料管中,即為抽提得到的細胞核蛋白。可以立即使用,也可以-70℃凍存。

2、 制膠  (1.5mm膠,大約30分鐘膠會凝)

試劑

濃度5.5%

H2O         ml

7.50

10*TBE       ul

500

40%丙烯酰胺   ml

1.50

50%甘油      ul

500

10%AP       ul

50

TEMED        ul

10

總體積       ml

10

待膠完全凝固后120v預電泳1h,緩沖液用預冷的0.5×TBE。

3、 蛋白與探針反應(注:蛋白濃度1 ug/uL ,上樣體積2 uL)

試劑名稱

陰性對照

樣品組

冷競爭

10×binding buffer

2

2

2

1ug/ul polydl.dc

1

1

1

50glycerol

1

1

1

1%NP-40

1

1

1

100m M Mgcl

1

1

1

200m M EDTA

1

1

1

Protein

-

+

+

標記探針(200 fmol

+

+

+

未標記探針(40 pmol)

0

0

+

H2O

+

+

+

總體積

20

20

20

混合后室溫放置20分鐘。

4、 上樣

預電泳完后馬上更換預冷的電泳緩沖液,加5ul的5×上樣緩沖液到樣品混合液中,馬上上樣電泳。180v ,60min。

5、 電轉移

將帶正電的尼龍膜放入0.5×TBE中平衡10分鐘。待電泳完成后將加有樣品的整塊膠取下電轉。轉膜緩沖液為預冷的0.5×TBE。300m A 30分鐘。

6、 交聯

轉膜完成后將膜取出,放在一張干凈的濾紙上,做好標記。于紫外燈下20cm處作用20分鐘。

7、 封閉

將交聯完成的尼龍膜取出放入洗凈的孵育槽,用封閉液封閉20分鐘。期間放于搖床上輕柔搖晃。(慢搖)。

8、 抗體反應

   倒掉封閉液。用封閉液將抗體稀釋300倍后,與膜完全作用30分鐘。期間放于搖床上輕柔搖晃。(慢搖).

9、 洗脫

        用1×的洗脫液清洗3次,每次5分鐘。搖床速度加大。

10、平衡

用平衡液平衡5分鐘。

11、ECL發光檢測

12、圖像分析(灰度比分析結果見EXCEl表格)

 

美人捕鱼作弊器 捕鱼达人3攻略和秘籍 拉霸王国app下载 好运来彩票投注平台 女仆游戏 广东时时20选8开奖结果查询 山西快乐10分前三走势 天津时时彩开奖结果 幸运快三代玩给50佣金 双色球蓝球分析 微信大富贵赢钱软件挂