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細胞培養轉染

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細胞轉染

貨號:GC1016

品牌:Servicebio

價格:¥300

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  一、實驗簡介

  細胞轉染是指將外源分子如DNA、RNA等導入真核細胞的技術。主要包括:電穿孔法、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染法、病毒介導的轉染等,理想的轉染方法是具有高轉染效率、對細胞毒性作用小等。其中脂質體轉染是常用的簡便轉染方法。

  脂質體(liposome)轉染方法的原理在于,陽離子脂質體表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹,形成DNA-脂復合體,被表面帶負電荷的細胞膜吸附。再通過膜的融合或細胞的內吞作用,偶爾通過直接滲透作用,將DNA轉運至細胞內,形成包涵體或進入溶酶體。當DNA從包涵體內釋放后,進入細胞質,再進一步進入核內實現轉錄、表達。

  二、siRNA/shRNA/miRNA/DNA轉染細胞實驗步驟(以6孔板為例)

  1 轉染前一天接種細胞于6孔板,5×104每孔,第二天轉染時細胞匯合度達到60%-70%每孔。

  2 轉染前半小時將完全培養基換無血清培養基1.9 ml。

  3 A液:RNA100pmol/DNA 2μg(根據核酸類型不同,用量不同)加入50 ul Opti-MEM無血清培養基,輕輕混勻,室溫靜置5min。

  4 B液:脂質體使用前輕輕混勻,脂質體5ul 加入50 ul Opti-MEM無血清培養基,輕輕混勻,室溫靜置5min。

  5 B液加入到A液中,用槍輕輕混勻,室溫靜止20min。

  6 將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中,邊滴加邊前后左右十字交叉輕輕搖晃。

  7 孵箱37℃培養4~6h,然后將無血清培養基換成完全培養基繼續培養。

  8 mRNA 水平的檢測:在轉染后24-48h后,用Real-time PCR的方法在mRNA水平進行檢測。

  9 蛋白水平的檢測:在轉染后48-72h后,用Western-blot或免疫組化的方法在蛋白水平進行檢測。

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