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細胞載體質粒

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基因合成/質粒構建/點突變

貨號:GC1034

品牌:Servicebio

價格:¥1000起

規格:

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  簡介:

  載體構建,又稱質粒構建,基因克隆,分子克隆,DNA重組等。

  基因克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復制的載體DNA連接,然后將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程,因此DNA克隆又稱分子克隆,基因操作或重組DNA技術。基因克隆涉及一系列的分子生物學技術,如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導入宿主細胞技術和重組子篩選技術等等。質粒構建完成之后,可以通過引物引入點突變的形式,實現目的基因的點突變。

  實驗流程:

  一、載體的選擇

  從總體上講,根據載體的使用目的,載體可以分為克隆載體,表達載體,測序載體,穿梭載體等。公司已有的各類載體見附表1。

  二、目的DNA片段的獲得 ---PCR擴增

  根據序列信息,人工化學合成短片段拼接成目的DNA片段。

  三、體外重組 ---酶切+連接

  四、導入受體細胞--質粒轉化

  載體DNA分子上具有能被原核宿主細胞識別的復制起始位點,因此可以在原核細胞如大腸桿菌中復制,重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增,最終獲得大量同一的重組DNA分子。將連接之后的質粒轉化到大腸桿菌感受態細胞中,將其涂布在含有質粒抗性的LB固體板上。

  五、重組子的篩選--抗性篩選-單克隆菌株挑選

  一般質粒載體上都會含有原核抗性,如氨芐霉素,卡那霉素等,故而僅有轉入目標質粒的大腸桿菌才能在抗性LB板種存活,并形成單一透亮的菌落。根據這一原理,對菌落進行挑取,搖菌(在含抗性的液體LB培養基中擴大培養,質粒會隨著菌的復制而復制),繼而使用質粒提取試劑盒,提取大量的質粒。

  六、陽性克隆的驗證

  ①第一步,酶切或者跑膠的方式初步驗證。

  ②第二步,進行測序分析,與目的基因序列進行比對,以最終確認目的基因。

  客戶提供信息:

  1.目的基因的詳細信息(種屬,基因ID,NM號);

  2.載體選擇或者要求;

  3.其他實驗要求

  樣本寄送須知:

  質粒載體等-20℃寄送

  交付結果:

  實驗報告,測序結果,質粒
 

  附表1

  哺乳動物常規表達載體:

分類 載體名稱 載體大小 標簽 原核抗性 應用
哺乳動物過表達 pcDNA3.1+ 5428bp / 氨芐 瞬表達
pEGFP-N1 4733bp EGFP綠色熒光 卡那霉素 瞬表達
哺乳動物基因編輯 pX459 V2.0 9175bp / amp Cas9

 

  慢病毒表達載體:

分類 載體信息 標簽 真核抗性 應用
慢病毒 過表達 LV2 CMV-EF1a-cGFP(2A)-puro cGFP綠色熒光 puro 穩定表達
LV4 CMV-IRES-puro / puro 穩定表達
慢病毒 沉默 LV1 hU6-EF1a-cGFP(2A)-puro cGFP綠色熒光 puro 穩定表達
LV3 hU6-PGK-EGFP(2A)-puro EGFP綠色熒光 puro 穩定表達
LV5 U6-cGFP(2A)Hygro cGFP綠色熒光 Hygro 穩定表達
LV8 U6-CMV-Firefly Luc(2A)-puro lucferase puro 穩定表達
LV10 U6-cGFP(2A)-puro cGFP綠色熒光 puro 穩定表達
LV11 PLKO.1-PURO / puro 穩定表達

 

  雙熒光素酶實驗專用載體:

分類 載體信息 標簽 原核抗性 應用
miRNA靶基因 psiCHECK 2.0 螢火蟲&海腎LUC 氨芐 Dual-luc assay
 
轉錄因子/啟動子活性類 pGL3 basic Firefly Luc 氨芐
pRL-SV40 Ranilla Luciferase amp
pGL3-promoter Firefily Luciferase amp

 

  實驗儀器展示:

PCR儀

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